發(fā)布時(shí)間 : 2020-06-24 閱讀次數 : 124
elisa作為經(jīng)典的免疫檢測方法,看起來(lái)很平常,然而真正做好它并不容易.有哪些方法可以借鑒呢？我們總結了幾點(diǎn)：
1. 確定您的樣本類(lèi)型和試劑盒可以兼容
常見(jiàn)樣本類(lèi)型有血清,血漿,細胞培養上清,如果是廠(chǎng)家實(shí)驗驗證過(guò)的,可根據產(chǎn)品說(shuō)明購買(mǎi)使用.【注意：血漿制備用到的抗凝劑有 EDTA 檸檬酸鹽 肝素等多種,相應的血漿性質(zhì)存在差異,需單獨確認兼容性】.
2. 試劑盒檢測范圍需要匹配樣本中標志物濃度
elisa試劑盒的定量檢測范圍需參考標準曲線(xiàn),在標準曲線(xiàn)最低和最高濃度區間內屬于線(xiàn)性范圍,其中的值是可信和可定量的.濃度高于線(xiàn)性范圍的樣品要稀釋到線(xiàn)性范圍內來(lái)測量,而濃度低于線(xiàn)性范圍的樣品,其測量值不能用于計算濃度,只能用做參考.有一種常見(jiàn)的相關(guān)情況是：健康人樣本中很多標志物的濃度偏低,測量值低于標準曲線(xiàn)最低值.
3. 樣本收集有講究
以血清為例,樣本收集可參考試劑盒說(shuō)明書(shū),但需注意以下要點(diǎn).樣本盡量用無(wú)菌管收集,避免細菌的酶類(lèi)和代謝產(chǎn)品對結果的影響.采集過(guò)程要避免溶血,因為紅細胞溶解釋放的活性物質(zhì)可能會(huì )影響檢測.保存過(guò)程中如有沉淀,應離心后取上清液.樣本若不立即測定,建議按照每次使用量分裝保存在 -20℃,每次檢測使用一管,即避免交叉污染和反復凍融,有能保證檢測結果的平行可比性.
4. 實(shí)驗前要準備好相應試劑
提前將所有試劑平衡到室溫環(huán)境,這個(gè)過(guò)程大致需半小時(shí)左右.洗液是濃縮液,如有結晶析出,需完全溶解后再進(jìn)行稀釋.A B 兩管顯色底物在使用前15分鐘按 1:1 配成混合液.為保證蛋白標準品溶液配制質(zhì)量,蛋白標準品為凍干粉,重溶前需將管子離心,加入說(shuō)明書(shū)指定的緩沖液,慢速在搖床上搖勻或顛倒混勻,至少 15 分鐘,不建議用槍頭吹打.溶解后如需保存,按每次使用量分裝后根據說(shuō)明書(shū)要求的溫度保存.梯度稀釋蛋白標準品時(shí),建議用聚丙烯管（對蛋白吸附力很低）,每步都要充分混勻且更換新槍頭,確保梯度準確性.
5. 儀器設備的準備也必不可少
相關(guān)設備包括移液器 洗板機/搖床和酶標儀.移液器的準確性對于ELISA實(shí)驗結果的可靠性十分關(guān)鍵,需要確保定期校準維護.搖床的使用是為了讓反應體系快速達到平衡,獲得穩定 可重復的結果.不用搖床對實(shí)驗通常的影響是,OD 值低,CV 大.酶標儀等設備使用前提前 15 分鐘開(kāi)機預熱.
6. 剩余的試劑盒材料要妥善保存
標準品分裝后按說(shuō)明書(shū)要求的溫度保存,這樣可以避免污染,對要求冷凍保存的標準品還可以避免反復凍融；酶標板放回錫箔紙袋,加入干燥劑,封緊封口,4℃保存.忌未將酶標板完全平衡至室溫,就放回錫箔紙袋,因為此時(shí)由于溫度差,酶標板上會(huì )有水汽,不利于穩定保存.
7. 預實(shí)驗：通常預實(shí)驗包括全部標準曲線(xiàn)和小量樣本.
預實(shí)驗有兩個(gè)主要目的,一來(lái)是熟悉實(shí)驗流程,發(fā)現可能忽略的問(wèn)題；二來(lái)是測試樣本和試劑盒是否匹配,一旦出現不匹配的情況,不至于浪費過(guò)多樣本.另外是對樣品中目的分析物的豐度作一下大致了解,以確定合適稀釋度.
8. 孵育時(shí)要保證溫度均勻,防止揮發(fā)變干
孵育時(shí)壓緊封口膜.多塊板一起實(shí)驗時(shí),要平放各板,不要疊放,以免因溫度不均造成漂移或邊緣效應.
9. 加樣要快速準確,避免氣泡
加樣時(shí)間宜控制在 15 分鐘內.加樣前要將樣本混勻,特別是凍存后融化的樣本（自然融化的血清等樣本會(huì )有分層現象）,應上下顛倒充分混勻,注意動(dòng)作輕緩,避免產(chǎn)生氣泡.如凍存融化后的樣本有沉淀,可以再次離心.整個(gè)加樣過(guò)程都要注意避免產(chǎn)生氣泡.氣泡會(huì )影響蛋白的相互結合,而影響反應進(jìn)行.
10. 手動(dòng)洗板的操作指南
加洗液要快速,沒(méi)有多道移液器可以使用洗瓶.洗液應新鮮配制,以免被其他試劑污染,或染菌.加好洗液后浸泡 30s-1min.甩板倒液要迅速干脆.倒液后在吸水紙上拍板,選用無(wú)粉塵和碎屑的優(yōu)質(zhì)吸水紙.需要用力拍板,使孔內沒(méi)有可見(jiàn)液體掛壁；但也不能太重,不能讓樣品干太久.酶標板拍干后立即做后續的加液.
11. 顯色反應的關(guān)鍵點(diǎn)
elisa試劑盒實(shí)驗是個(gè)酶促底物顯色反應,隨時(shí)間增加,顯色變深,所以選擇最佳時(shí)間終止反應是得到準確的標準曲線(xiàn)和樣本濃度的重要因素.終止過(guò)程要完全.使用的 TMB 底物時(shí)完全終止點(diǎn)是黃色,不會(huì )有任何程度的藍色或綠色,終止過(guò)程中必要時(shí)可以震蕩 96 孔板,或用槍頭抽吸混勻（終止液含強酸,避免腐蝕）.
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